ห้องละหมาด เป็นบริการพิเศษที่หอสมุดจอห์น เอฟ เคนเนดี้ ได้จัดไว้สำหรับผู้ใช้บริการ บุคลากร นักศึกษาและประชาชน ที่นับถือศาสนาอิสลาม ให้ได้มีโอกาสปฏิบัติศาสนกิจทางศาสนาได้ตลอดเวลาที่ใช้บริการในหอสมุด  โดยจัดสถานที่ไว้บริเวณชั้น 2 ตึกจอห์น เอฟ เคนเนดี้ (ตึกเก่า)  แบ่งเป็น 2 ห้อง คือ ห้องละหมาดสำหรับสุภาพบุรุษ และห้องละหมาดสำหรับสุภาพสตรี