Page 26 - 067

12

ปั่นเหวี่ยงเพื่อให้เซลล์ตกตะกอน ล้างด้วยน้้ากลั่นสะอาดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว จากนั้นสกัด DNA ออก
ิ่
ด้วยชุดทดสอบ QIAgen จากนั้นท้าการเพมปริมาณของชิ้นส่วน DNA ด้วยเทคนิค (Polymerase
ิ
Chain Reaction: PCR) ที่จ้าเป็นต้องใช้องค์ประกอบส้าหรับการเพมจ้านวนดังนี้ ดีเอนเอแม่พมพ,
ิ่
์
็
DNA polymerase ต้องเป็นเอนไซม์ชนิดทนความร้อน, ไพรเมอร์ และ deoxyribonucleotide
triphosphates (dNTPs) 4 ชนิด โดยไพรเมอร์ universal primer 1492r และ bacteria-specific
primer 27f เป็นไพลเมอร์จ้าเพาะส้าหรับแบคทีเรีย ส่วนในกลุ่มของอาเคียร์จะใช้ไพรเมอร์ Arch21f
และ Arch958r (Lane, 1991) และใช้สารลารละลาย KCl 50 mM, Tris–HCl (pH 8.4) 20 mM
และ MgCl 25 mM ในขั้นตอนการท้า PCR จะเตรียมสารส้าหรับท้าปฏิกิริยา โดยปฏิกิริยาการ

สังเคราะห์จะเกิดขึ้นซ้้า ๆ เป็นปฏิกิริยาลูกโซ่โดยการเกิดขึ้นในแต่ละรอบจะมีขั้นตอน 3 ขั้นที่
ประกอบไปด้วยขั้นตอน ดังนี้
1. ขั้นตอนการแยกสาย DNA เกลียวคู่ออกจากกัน (Denaturation) เป็นขั้นตอนของการ
o
ุ
แยกสายของ DNA เกลียวคู่ของ DNA แม่พมพ ให้เป็นสายเดี่ยว โดยใช้อณหภูมิประมาณ 90-95 C ที่
ิ
์
เป็นอุณหภูมส้าหรับการสลายพันธะไฮโดรเจนระหว่างคู่เบส
2. ขั้นตอนการจับกันของไพร์เมอร์กับ DNA แม่แบบ (Annealing) หลังจากแยกสาย DNA
o
ั
จากกนแล้วจึงลดอณหภูมิลงที่ 50-55 C เพอให้ DNA สังเคราะห์สายสั้น ๆ หรือเรียกว่า Primer
ื่
ุ
สามารถเข้าไปจับกับ DNA แม่พิมพ์สายเดี่ยวบริเวณที่มีล้าดับนิวคลีโอไทด์คู่สม
3. ขั้นตอนการสังเคราะห์ DNA สายใหม่จากไพร์เมอร์ (Extension) เป็นขั้นตอนที่มีการ
o
สร้างสาย DNA สายใหม่ที่ต่อจาก Primer ในทิศจาก 5′ ไป 3′ ที่อุณหภูมิ 68-72 C
เทคนิควิเคราะห์ความหลากหลายของจุลินทรีย์ที่ได้รับความนิยมในการน้ามาใช้คือเทคนิค
DGGE เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพสามารถใช้แทนเทคนิคเดิม ๆ ได้หลักการในการด้าเนินการเริ่มจาก

น้าส่วนของสาย DNA ที่ได้ถูกแยกไปวิเคราะห์หาล้าดับเบส มาจากเทคนิค DGGE คือสายของ 16S
rRNA gene ของแบคทีเรียแต่ละชนิด ซึ่งสามารถน้าไปเปรียบเทียบกับสายของ 16S rRNA gene ของ
ื่
แบคทีเรียที่ได้ทราบถึงชนิดแล้วจากฐานข้อมูล เพอตรวจสอบชนิดของแบคทีเรียว่าเป็นชนิดใด ขั้นตอน
ของ DGGE analysis เริ่มจากการสกัด DNA ทั้งหมด และท้าให้บริสุทธิ์ จากนั้นใช้ Universal primer
เข้าไปจับกับสาย DNA บริเวณที่จ้าเพาะเจาะจงทบริเวณส่วนของ 16S rRNA gene จากนั้นท้าการแยก
ี่
ู
สาย DNA จากตัวอย่าง โดย DGGE ซึ่งสาย DNA ที่แยกที่ได้จาก DGGE จะถกแยกออกจาก DGGE gel
ั
เพอน้าไปใช้หาล้าดับเบส เป็นการหาความสัมพนธ์ของล้าดับเบส 16S rRNA gene ที่ได้มาจากการ
ื่
ล้าดับเบส (Sequencing) และจ้าแนกแจกแจงชนิดของจุลินทรีย์ในตัวอย่างที่น้ามาทดสอบได้

2.2 งานวิจัยที่เกี่ยวข้อง
2.2.1 การย่อยสลายไร้อากาศพรรณไม้ใต้น้้าและการย่อยสลายร่วมกับซับสเตรตชนิดต่าง ๆ

Costa et al. (2012) ศึกษาความเป็นไปได้ในการผลิตมีเทนชีวภาพจากสาหร่ายขนาด
ั
ั
ใหญ่ Ulva spp. และ Gracilaria spp. ที่ย่อยสลายร่วมกบสลัดจ์กัมมนต์เหลือทิ้ง พบว่ามีความเป็นไป
ได้ในการผลิตมีเทนจากสาหร่ายขนาดใหญ่ 4 สายพนธุ์ ของจีนัส Ulva และ Gracilaria จากการ
ั
ทดลองแบบแบตช์ที่ควบคุมอณหภูมิที่สภาวะเมโซฟลิกและมความเข้มขนของของแข็งทั้งหมด ร้อยละ
ุ
ี
้
ิ
็
2.5 พบว่าผลผลิตมีเทนต่อหน่วยของแขงระเหยได้ที่ได้จาก Ulva sp. มีค่า 196±9 L-CH /kg-VS ซึ่ง
4